病毒颗粒样（VLP）疫苗分析检测技术-中科森辉微球
疫苗分为预防性疫苗和治疗性疫苗，在疾病的预防和治疗中发挥了重要的作用。我国是全球最大的疫苗消费国，市场巨大、增长快速。卡欧斯泰罗2016年人用疫苗市场约270亿元，并保持10-15%的增长速度；2016年兽用疫苗市场约203亿元，并保持15-20%的增长速度全能篮板痴汉。病毒样颗粒（VLP）疫苗具有和天然病毒相似的形态和尺寸、抗原性和免疫原性，可诱导机体免疫反应产生抗体，在疫苗中占据了重要的地位。
分析检测技术应用于疫苗培养、分离纯化工艺开发、产品检测等各个环节。快速、准确地对疫苗进行分析表征，对于建立和优化疫苗培养和分离纯化工艺，提高产品质量、降低生产成本，以及确保疫苗安全、有效都具有重要的意义。
与其他生物分子相比，VLP疫苗往往分子量更大（分子量高达数百万甚至数千万）、结构更加复杂（多个亚基组装）、稳定性更差，因此，选择合适的分析方法显得尤其重要，建立准确、可靠的分析方法的难度也更大。
VLP疫苗的表征内容主要包括分子量、纯度、结构、活性、稳定性等，相应的分析检测技术主要包括电泳（以及Western blot）、ELISA、圆二色光谱、透射电镜、超速离心、高效液相色谱、场流分级、动态光散射等技术[1-4]。
技术名称
特点
应用
电泳
操作简单、定性半定量
纯度、分子量
ELISA
高通量、快速
体外活性
圆二色光谱
操作简单、快速
二级结构
透射电镜
方便、直观，但仪器昂贵
分子大小、形貌
超速离心
分析速度慢、操作繁琐
纯度、沉降系数
高效液相色谱
快速、准确，相对分子量
纯度、颗粒大小、分子量
场流分级
无损伤表征疫苗真实结构
纯度、颗粒大小、分子量
光散射
快速、准确，绝对分子量
颗粒大小和分布
表1 疫苗分析检测技术
1电泳
电泳是一种利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术。在生物分子检测中，SDS-PAGE电泳应用最为广泛。SDS-PAGE电泳又分为还原电泳和非还原电泳。VLP疫苗分子尺寸大，一般难以用非还原电泳进行表征；还原电泳在样品处理时加入了还原剂（DTT或巯基乙醇），可将VLP疫苗打开，完全还原成单体的形式。如CHO细胞表达的乙肝疫苗，还原电泳结果上显示出分子量分别为23 kD、27 kD和30 kD的3条特征条带，分别对应S蛋白的单体和两种糖基化形式；汉逊酵母表达的乙肝疫苗，还原电泳结果上显示出分子量为23 kD的S蛋白单体；口蹄疫疫苗的还原电泳结果上显示出分子量在27-30 kD的VP1、VP2和VP3蛋白[1]。SDS-PAGE电泳与荧光标记二抗的Western Blot结合，可以实现对病毒亚基的准确定量。
需要注意的是，电泳往往只能检测VLP疫苗的纯度和亚基的分子量，无法表征VLP疫苗的整体分子量和结构的完整性与变化情况（比如是否形成聚集体或发生解聚）。
2 ELISA
酶联免疫吸附方法（ELISA）是将抗原与抗体的免疫学反应和酶的催化反应相结合而建立的一种分析方法。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速、易于自动化操作等特点，广泛用于抗原或抗体的定性和定量分析罗瑞康。ELISA在VLP疫苗体外活性测定中也具有重要的应用，广泛用于发酵和分离纯化工艺的优化、发酵水平和纯化效果的表征，以及产品的体外活性鉴定中。VLP疫苗的体外活性与其组装结构具有密切关系，有时还需要采用其他结构表征（如高效液相色谱-光散射（动态光散射、多角度激光）、场流分级-光散射等）手段进行分析上山上山爱。中科院过程所苏志国研究团队在研究乙肝疫苗在超滤过程中疫苗结构变化时，采用ELISA对疫苗的体外活性进行表征，发现超滤过程导致疫苗形成尺寸更大的聚集体的比活只有正常组装体比活的20%左右[5]；在研究盐的种类和浓度对乙肝疫苗结构和免疫原性影响时，不同浓度（0-4 M）的氯化钠对乙肝疫苗的结构和活性无明显影响，而硫酸铵对乙肝疫苗的结构和活性具有明显的影响，随着硫酸铵浓度的升高，疫苗聚集体含量增加，活性急剧下降，当硫酸铵浓度达到2 M时，其活性下降为原来的20%左右，即使透析除去硫酸铵，其活性也没有明显的变化，表面其结构变化和活性下降过程是不可逆的[6]。
图1 中科院过程所苏志国研究团队研究不同浓度硫酸铵孵育并经透析后的HBsAg样品的场流分级-多角度激光检测谱图（上图）和透析前后样品的ELISA分析结果（下图）
3 圆二色光谱
圆二色光谱（简称CD）是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在接近其生理状态的溶液状态下测定，对构象变化灵敏，是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中。在VLP疫苗的研究中，CD主要用于疫苗的二级结构分析、疫苗样品和标准品等的比对，以及疫苗结构变化的表征。
大多数蛋白形成聚集体后，其α-螺旋的比例一般会下降，β-折叠的比例一般都会增加。在HBsAg超滤行为研究中，HBsAg聚集体的CD分析结果表明，α-螺旋的比例从正常组装体的48.2%降低到34.4%，但β-折叠的比例没有变化，而β-转角的比例从29.6%增加到38.7%[5]。
图2 HBsAg正常组装体和大尺寸聚集体的CD光谱
α-螺旋
β-折叠
β-转角
无规卷曲
HBsAg
48.2 ± 4.2
0
29.6 ± 3.8
22.2 ± 4.0
HBsAg聚集体
34.4 ± 4.0
0
38.7 ± 2.4
26.9 ± 1.6
表2 HBsAg正常组装体和大尺寸聚集体的二级结构
4 透射电镜
透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM）技术作为快速检测病毒的手段之一，在病毒检测中发挥着异常重要的作用。传统光学显微镜的最小分辨率只有200 nm，TEM的分辨率最小可以达到0.1 nm，可以看到在光学显微镜下无法看清的亚显微结构或超微结构，它是迄今为止能够直接观察病毒和VLP疫苗颗粒具体形态的主要方法。但是要对VLP疫苗进行TEM观察，需要对样品进行染色、固定、干燥、高真空下电子轰击，严重时有可能对样品造成一定程度的变形或破坏。
5 超速离心
超速离心技术在VLP疫苗的检测中发挥着重要的作用，是VLP疫苗检测中不可或缺的一种方法。常用的超速离心技术主要包括差速离心法和密度梯度离心法。超速离心也是一种小规模纯化VLP疫苗的有效方法，通过超速离心可以将疫苗培养液浓缩和纯化，获得VLP疫苗纯品，供后续分析和其它性能表征。分析型的超速离心技术还可以直接测定VLP疫苗的浮力密度和和沉降系数，比如口蹄疫病毒、猪水泡病病毒等。以口蹄疫病毒的检测为例，主要有两种方法即氯化铯等密度梯度离心和蔗糖速率区带离心。氯化铯等密度梯度离心需要较长时间（6小时以上）的离心以形成与口蹄疫病毒相平衡的氯化铯梯度。蔗糖速率区带离心所需时间大大缩短，Barteling等人采用5.0 mL的超速离心管铺设25%和10%两个蔗糖梯度大清洗冤录，在45000 rpm转速下离心30 min即可检测完整的口蹄疫病毒[7]。
6 高效液相色谱
高效液相色谱根据其分离原理，可以分为多种类型。在生物活性大分子的分析检测中黄允才 ，最常用的是高效液相体积排阻色谱（High Performance Liquid Size Exclusion Chromatography, HPSEC）。HPSEC的介质粒径较小（一般在几微米至十几微米之间），其理论塔板数高达数万，分辨率高，分离度较好。HPSEC主要用于VLP疫苗分子量、纯度和含量的测定。通过标准VLP疫苗样品在分析柱上的保留体积，可以大致判断纯化样品的分子量。由于VLP疫苗的分子量与其亚基的分子量相差较大，因此在色谱柱上的保留体积也相差很大，通过HPSEC可以很容易的将完整的疫苗颗粒与亚基分开，进而可以对纯化样品中疫苗颗粒的完整性进行快速的检测步步封疆。同时由于HPSEC的灵敏度高，通常能够达到微克级的检测，被测组分的量与色谱的响应值（峰高或者峰面积）成正比，用不同浓度的标准样品建立浓度-峰面积（或峰高）的标准曲线，可以实现对微量疫苗样品的快速、准确定量。
在分子量测定中，HPSEC只能测相对分子量，通常采用一组已知分子量的单分散相样品在同样条件下作一系列色谱图，以各洗脱峰位置的洗脱体积Ve对lgM作图得到校正曲线，依次作为数据处理的基准。这样就增加了分子量测定的难度，延长了实验时间，降低了分析结果的可靠性。对于结构与标准物质不相近的样品而言，所采用的校正曲线不能很好符合实际情况，因而测得的分子量的误差有可能很大。另外，在HPSEC过程中，样品与介质间的非特异性相互作用也需要特别注意，尤其是对于高分子聚合物的分析介质，否则由于非特异性相互作用可能导致样品出峰时间的延迟、回收率的降低，甚至样品结构的变化，从而影响分析结果的准确性。
7 场流分级
场流分级（Field-flow fractionation江智明, FFF）是利用外场和流体流动的共同作用蓝均天，将分子量、形状、密度和荷电性质等存在差异的粒子实现分离的一种分析方法。FFF是在超薄、带状的腔室里进行的，腔室是由一个间隔物夹在两个平板间形成的，流体在腔室中是呈抛物线型的，越靠近腔室厚度的中间位置，流速越快。与腔室液流垂直的方向上存在一个外场错流，使得不同的组分在抛物线型流体中的平衡分布情况不同（图3）。因此，每种样品因其平衡位置的不同而具有不同的迁移速度。FFF在蛋白质、抗体、多糖、脂质体、VLP疫苗（乙肝疫苗、流感疫苗、口蹄疫疫苗等）等生物大分子领域都具有重要的应用。以HBsAg为例，采用FFF分离并与多角度激光散射器联用的分析技术，得到HBsAg的分子大小（均方根回旋半径）为24.4 nm（图4）；在考察盐种类和浓度对HBsAg稳定性的研究中，发现随着硫酸铵浓度的增加，HBsAg正常组装体的含量逐渐降低，聚集体含量逐步增加（图1）[6]。
FFF的特点和优势主要包括如下几方面：1）与HPEC相比的最大区别在于分离腔室中无需填充介质，避免了样品与介质之间的相互作用；2）分级范围广（1 nm-10 μm），可以分离超大分子，如分子量达到1800万的聚丙烯酰胺等，因此可以很好地满足VLP疫苗颗粒分离的要求；3）分辨率高，与HPSEC分析方法相当；4）检测器联用方便，可以与示差、紫外和多角度光散射等检测仪器联用。目前中科院过程所生化工程重点实验室检测平台目前即采用非对称垂直流场流分级耦合多角度激光散射的分级分析方法,对于普通的分析检测方法不能满足的需求，可以尝试使用该方法。
图3 FFF原理示意图
图4 HBsAg样品的场流分级-多角度激光检测谱图
8 动态光散射
动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）是测量在溶液中颗粒的大小、粒度分布和（在某些情况下）纳米颗粒在液体中的形状最通用和有用的一项技术。该技术能够对样品实时、无干扰的快速测量，已经成为稀溶液中纳米颗粒表征的重要方法，其测量尺寸从1纳米到几微米范书恺，动态光散射技术已被广泛应用于生物、医药、环境以及化工等领域的纳米颗粒的粒度测量。其测量原理是基于被测粒子在溶液中的不规则布朗运动，这种不规则的运动使得散射光光强相对于某一平均值产生随机的涨落，并且这种涨落与颗粒的粒径呈现负相关的关系，通过计算这种涨落变化的时域自相关函数李孟元 ，就可以计算出影响这种变化的颗粒的粒径。
多角度激光散射（Multi-angle laser light scattering, MALLS）是一种应用较为广泛的一种光散射技术吉成俊 。当激光照射到样品时，就会在各个方向产生散射光，MALLS技术就是通过测定多个角度（最多18个角度）散射光的强度，进而测定出分子的绝对分子量、水力学半径等参数的技术。散射光的强度与分子量、质量浓度、散射光角度等因素存在一定关系，分子量可根据下式计算：
20世纪80年代科学家又建立起了高效液相体积排阻色谱与多角度激光光散射仪联用（HPSEC-MALLS）的新技术，光散射强度与分子的大小以及分子量有直接的关系，而体积排阻色谱能分离不同尺寸以及分子量的分子，根据这两个特点，可以获得许多有价值的数据。
MALLS与其他分析技术相比，具有以下优势： 1）与传统HPSEC相比，MALLS不需要标准品及标准曲线，可以直接测得大分子物质的绝对分子量、分子量分布，长生草 以及分子的形状等信息。而HPSEC需要标准品进行标准曲线的校准，还需要对分子形状做出预先假设，步骤繁琐而且误差较大。2）与质谱相比，质谱仪虽然在准确度和精确度等方面比其他手段略胜一筹，但其价格昂贵，非一般的实验室所能承受；同时，其测定分子量的范围也有一定的局限性，测量时对样品的缓冲盐成分也有严格限制，而且必须将分子打碎后再进行分析测试，这样处理样品都会导致样品结构被破坏。而MALLS的分子量测量范围从500-109 Da，甚至可达几亿Da, 分子尺寸从10 nm-1μm以上，测量范围几乎包括所有的大分子，而且是在大分子的水溶液中进行测定，不会破坏大分子的结构，所以可以测定混合物及多分散性物质的分子量分布。其准确度和精确度分别在97%、99%以上。此外，MALLS仪器造价较低，售价仅为质谱的1/3至1/6。③MALLS作为一个独立的分析仪器，既可单独使用，又可与高效液相色谱、场流分级等联用，是测量绝对分子量直接的方法。
由于光散射信号的强弱与样品浓度以及颗粒的大小直接相关，因此对于大分子的聚集体而言，其光散射信号非常强，很容易检测到聚集体的有无以及聚集体的相对含量。比如在HBsAg的离子交换层析中，紫外检测器是无法检测出微量的聚集体的，而MALLS对大分子及其灵敏，可以检测到聚集体的存在（图5）[8]。与场流分级仪器偶联使用，既不需要标准样品校正，还可以避免样品颗粒与HPSEC柱子的剪切，从而更准确的测量颗粒样品在溶液中的真实状态。
图5 离子交换层析的HBsAg样品的HPSEC-MALLS分析谱图
总之，与其他生物大分子相比，VLP疫苗的分子量更大、结构更加复杂，检测难度也更大骸骨灰烬。在工艺开发和产品检测过程中，尤其要关注疫苗颗粒的结构完整性和结构变化情况。除常规蛋白质的检测技术外，一些新型的分析检测技术，比如高效液相色谱和多角度激光散射联用、场流分级与多角度激光散射联用等技术，在VLP疫苗产品开发中，发挥了越来越重要的作用。
中科森辉微球技术（苏州）有限公司联合中科院过程所生化工程重点实验室建立的生物制品解决方案与检测平台已经运行，更多的关于VLP疫苗的检测技术，请联系相关人员咨询。
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VLP 的纯化
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